Il museo è ospitato nell'antico palazzo, sede del comune fino agli anni sessanta. L'edificio attuale è il risultato di una serie di modifiche architettoniche cominciate da Galeotto Malatesta, signore di Rimini, la cui famiglia governò a Sansepolcro durante il XIV secolo.

Nel 1850 furono raccolte nel palazzo varie opere provenienti dal territorio circostante e nel 1892 vi fu trasferito, dalla chiesa dell'ospedale della Misericordia, il Polittico dipinto da Piero della Francesca.

Piero della Francesca nacque a Sansepolcro intorno al 1412 e questa città ospita, nel Museo Civico, quattro opere dell’artista. Il Polittico della Misericordia, che fu commissionato a Piero dall’omonima compagnia di Sansepolcro nel 1445, la Resurrezione, un grande affresco dipinto da Piero della Francesca sulla parete centrale della Sala dell’Udienza. L’opera è considerata dalla critica, tra le più rappresentative dell’artista. L’affresco rappresentante San Giuliano, ritrovato nel 1954 nell’antica chiesa di Sant’Agostino, denominata in seguito Santa Chiara e infine l’affresco staccato raffigurante San Ludovico, proveniente dal Palazzo Pretorio.

Il fulcro del museo è la sala dove Piero ha realizzato la Resurrezione, emblema e simbolo della città. Nel Museo, oltre a quelle dedicate a Piero della Francesca, sono visitabili altre 15 sale con opere che vanno dal XIV al XX secolo, oltre al tesoro della cattedrale e una sezione archeologica nei saloni seminterrati.